انسانی بیماری کی سب سے عام وجہ وائرل انفیکشن ہے۔ لاکھوں لوگ اب بھی وائرل انفیکشن سے مر رہے ہیں، بشمول ہیپاٹائٹس اور ہیومن امیونو وائرس (HIV)۔
Emerging viruses are also causing severe problems for the human population. There have been several outbreaks of emerging viruses in various countries, including avian influenza A (H5N1), severe acute respiratory syndrome-coronavirus سارس-کووی (سارس-کووی), pandemic swine flu A (H1N1) virus 2009, Ebola virus (ZIKV 2015), and pandemic سارس-COV کے 2 2015.
SARS/CoV-2019 کی وجہ سے حالیہ کورونا وائرس کی بیماری 2 کی وبا اس بات کی ایک بہترین مثال ہے کہ کس طرح وائرل انفیکشن عالمی معیشت اور صحت عامہ کے لیے سنگین خطرہ بن سکتا ہے۔ وائرل انفیکشن کا مقابلہ کرنے کا پہلا قدم فوری اور درست تشخیص حاصل کرنا ہے۔ وبائی امراض کے مناسب علاج، کنٹرول اور روک تھام کے لیے مریض کے نمونے میں وائرس کا جلد اور درست طریقے سے پتہ لگانا ضروری ہے۔
وائرس کی تشخیصی تکنیک کا تعارف
- میڈیکل وائرس کی روایتی لیبارٹری تشخیص برانن چکن کے انڈوں، ٹشو کلچر یا جانوروں کے ماڈل میں وائرس کو الگ کر کے کی جاتی ہے۔ پھر، الیکٹران مائکروسکوپی کا استعمال نمونوں میں کسی بھی وائرل ذرات کو بصری طور پر جانچنے کے لیے کیا جاتا ہے۔
- روایتی تشخیصی آلات اکثر استعمال کرنے میں مشکل، مہنگے، سست، ناکارہ، اور دوبارہ پیدا کرنے کے قابل نہیں ہوتے ہیں۔ سالماتی تشخیص نے وائرولوجی میں انقلاب برپا کر دیا ہے، مریضوں کے نمونوں میں وائرس نیوکلک ایسڈ کی موجودگی کا پتہ لگانا۔
- اس حقیقت کے باوجود کہ بہت سے روایتی طریقوں کی جگہ نیوکلک ایسڈ پر مبنی طریقوں نے لے لی ہے، امیونو پر مبنی تکنیک وائرل انفیکشن کی کھوج اور نگرانی میں اہم کردار ادا کر رہی ہیں۔
- امیونولوجیکل طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے وائرل انفیکشن کا پتہ لگانے میں طبی نمونوں میں اینٹی وائرل اینٹی باڈیز اور وائرل اینٹیجنز کی شناخت شامل ہے۔ ہم طبی وائرس کی تشخیص کے لیے کچھ مالیکیولر تشخیصی اور امیونولوجیکل طریقوں پر بات کریں گے۔
وائرس کی مالیکیولر تشخیصی تکنیک
نیوکلک ایسڈ پر مبنی مالیکیولر تشخیصی تکنیکوں سے تشخیصی وائرولوجی میں انقلاب برپا ہوا ہے۔ وہ تیز، زیادہ حساس اور زیادہ مخصوص ہیں۔ یہ طریقے نیوکلک ایسڈز کی مخصوص ترتیبوں کا پتہ لگا سکتے ہیں اور ان کا استعمال تقریباً تمام وائرسوں کی تشخیص کے لیے کیا جا سکتا ہے جو انسانوں پر اثر انداز ہوتے ہیں۔
A. نیوکلک ایسڈ پر مبنی امپلیفیکیشن تکنیک
- سالماتی تکنیکوں کے ذریعہ وائرل جینوم مواد کو بڑھانا انتہائی حساس اور عین مطابق ہے۔ یہ تیزی سے تشخیص کی اجازت دیتا ہے اور بیک وقت متعدد وائرسوں کا پتہ لگا سکتا ہے۔
- ایسے وائرسوں کا پتہ لگانے کے لیے جن کی کاشت کرنا مشکل یا ناممکن ہے، ثقافت میں آہستہ بڑھنے والے وائرس، یا اینٹی جینک تغیرات والے وائرس، نیوکلک ایسڈ کو بڑھانے والی تکنیکیں بہت مددگار ثابت ہو سکتی ہیں۔
- In diagnosing viral infections caused from several viruses, the nucleic acid amplifying tests are extremely popular. They include hepatitis C virus, dengue virus and Epstein-Barr virus(EBV), influenza viruses as well as Zika virus (ZIKV), Ebolavirus, and coronavirus.
نیوکلک ایسڈ پر مبنی امپلیفیکیشن تکنیک کی مثالیں۔
مختلف قسم کے نیوکلک ایسڈ ایمپلیفیکیشن کے طریقے ہیں جنہیں لیبارٹری میں وائرل انفیکشن کی تشخیص کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ یہ سب ذیل میں زیر بحث ہیں۔
1. پولیمریز چین ری ایکشن (PCR)
- پیسیآر is a common example of a nucleic acid amplification test.
- ملیس اور فالونا کی تخلیق کے بعد سے، اس نے سالماتی تشخیص میں انقلاب برپا کر دیا ہے۔
- پیسیآر involves the extraction and purification DNA molecules and exponential amplification using an exponential DNA polymerase.
- The amplified product can then be detected using a variety of techniques after the پیسیآر reaction. These include gel electrophoresis and colorimetric methods as well as sequencing.
- اس کے آغاز سے، پیسیآر is used to detect human viral infections. The overall clinical sensitivity ranges from 77.8% up to 100% and the clinical specificity ranges from 89% up to 100%.
- کی استعداد پیسیآر makes it a versatile tool. There are many variations of پیسیآر, but the two most important ones are reverse transcription-PCR (RTPCR) and real-timePCR. The first was used to amplify ribonucleic acids (RNA) targets. The second was used to measure deoxyribonucleic acids (DNA) in real-time during پیسیآر رد عمل
فوائد
- حساس، مخصوص
- پتہ لگانے کا ایک وسیع پیمانے پر استعمال شدہ نیوکلک ایسڈ پر مبنی طریقہ
- ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کی صلاحیت
حدود
- اعلی آلودگی کا خطرہ
- روکنے والوں کی سفارش نہیں کی جاتی ہے۔
- یہ محنت طلب اور وقت طلب ہے۔
- قابلیت
- جیل دستاویزات کا سامان اور تھرمل سائیکلر کی ضرورت ہے۔
2. ریورس ٹرانسکرپشن-PCR (RT-PCR)
- RT-PCR کو RNA کے اہداف کو بڑھانے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔
- This technique uses reverse transcriptase to convert viral RNA targets to complementary DNA (cDNA). The resulting cDNA can then be amplified using conventional پیسیآر.
- اپنے قیام کے بعد سے، RTPCR کا استعمال RNA وائرس وائرس کے ذریعے انسانی انفیکشن کی تشخیص کے لیے کیا جاتا رہا ہے۔
- روایتی RTPCR نے مجموعی طور پر 73% سے 100% کی حساسیت ظاہر کی، اور پتہ لگانے یا وائرل انفیکشن کے لیے 99% سے 100% کی مخصوصیت۔
فوائد
- حساس، مخصوص
- ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کی صلاحیت
حدود
- RNA کو سنبھالنا مشکل ثابت ہو سکتا ہے۔
- ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کی صلاحیت
- یہ وقت طلب اور بوجھل ہے۔
- نسبتاً مہنگا ہے۔
- روکنے والوں کی سفارش نہیں کی جاتی ہے۔
- Some RNA viruses may have high mutation rates and mutant regions within پیسیآر, which can lead to decreased sensitivity.
3. ریئل ٹائم پی سی آر
- ریئل ٹائم پیسیآر systems allow for simultaneous viral nucleic acids amplification and detection.
- نمونے سے فلوروسینس کی مقدار وہی ہے جو ایک امپلیفیکیشن پروڈکٹ کی موجودگی کا تعین کرے گی۔
- خصوصی تھرمل سائیکلر نمونوں سے فلوروسینس اخراج کی نگرانی کرتے ہیں۔
- SYBR گرین، TaqMan اور مالیکیولر بیکن کیمیکلز کو ایمپلیفیکیشن مصنوعات کا پتہ لگانے اور ان کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
- SYBR گرین ڈائی ڈبل سٹرینڈڈ dsDNA (dsDNA) کے معمولی لوپ سے منسلک ہوتا ہے، اور جب مناسب روشنی سے پرجوش ہوتا ہے، تو یہ بہتر فلوروسینس دکھاتا ہے۔ یہ جمع شدہ dsDNA کی مقدار کے ساتھ براہ راست متناسب ہے۔
- TaqMan probes are DNA oligonucleotides that have a fluorescent dye called reporter at one end and a quencher at the other. TaqMan probes can be used to hybridize with an internal region of a product پیسیآر.
فوائد
- انتہائی حساس اور عین مطابق
- بند ٹیوب آپریشن کراس آلودگی کے خطرے کو کم کرتا ہے۔
- تیز رفتار اور محنت کش
- ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کی جین ٹائپنگ
- وائرل بوجھ کا مقداری تعین
حدود
- لیبارٹری کے مہنگے آلات اور فلوروسینٹ پروب کی ضرورت ہے۔
- TaqMan پروب ڈیزائن کے لیے ہدف نیوکلک ایسڈ کی ترتیب کے بارے میں مکمل معلومات درکار ہیں۔
- SYBR سبز طریقہ: پرائمر ڈائمر آرٹفیکٹ ایک مسئلہ ہوسکتا ہے۔
- روکنے والوں کی سفارش نہیں کی جاتی ہے۔
4. ٹرانسکرپشن پر مبنی ایمپلیفیکیشن کے طریقے
- ٹرانسکرپشن پر مبنی ایمپلیفیکیشن طریقہ میں نیوکلک ایسڈ سیکوینس بیسڈ ایمپلیفیکیشن (NASBA) اور ٹرانسکرپشن میڈیٹیڈ ایمپلیفیکیشن (TMA) شامل ہیں۔
- TMA اور NASBA بہت ملتے جلتے ہیں۔ وہ دونوں isothermal amplification کی تکنیک ہیں۔
- درجہ حرارت جس پر ایمپلیفائنگ کا پورا عمل ہوتا ہے 41 ° C ہے۔
- دونوں صورتوں میں وائرل RNA ہدف کو RT کا استعمال کرتے ہوئے cDNA میں تبدیل کرنا شامل ہے، اور پھر RNA Polymerase متعدد کاپیوں کی ترکیب کرتا ہے۔
- TMA اور NASBA کے دو انزائمز (RT) اور RNApolmerase (NASBA کے تین انزائمز ہیں: Avian myeloblastosisvirus reverse transscriptase، RNase H اور T7 RNA Polymerase)۔
(i) NASBA عمل
- ٹارگٹ وائرل RNA کو ضرب دینے کے لیے NASBA کے عمل میں تین انزائمز اور دو پرائمر استعمال کیے جاتے ہیں۔
- پرائمر 1 (P1) کا اپنے 5′ اختتام پر T7 RNA پولیمریز پروموٹر ریجن ہے، اور اس کے 3' اختتام پر P1 ترتیب رکھتا ہے جو کہ ہدف وائرس RNA ترتیب کے لیے تکمیلی ہے۔
- پرائمر 2 (P2) ایک ترتیب پر مشتمل ہے جو cDNA اسٹرینڈ کی تکمیل کرتا ہے۔
- ایمپلیفیکیشن ری ایکشن P1 کا استعمال کرتے ہوئے وائرل DNA کی cDNA کاپیوں کی RT کے ذریعے پیداوار کے ساتھ شروع ہوتا ہے۔
- RNase H RNA DNA ہائبرڈ مالیکیولز سے وائرل RNA کو ہٹانے کا ذمہ دار ہے۔
- جاری کردہ DNA اسٹرینڈ کو پھر RT کے ذریعے dsDNA مالیکیولز کی ترکیب کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
- T7 RNA پولیمریز وائرل RNA کی بہت سی کاپیوں کو نقل کرنے کے لیے ٹیمپلیٹس بنانے کے لیے dsDNA مالیکیولز کا بھی استعمال کرتا ہے۔
- اس چکر کو کئی بار دہرایا جا سکتا ہے اور اس کے نتیجے میں کئی وائرل DNA کاپیاں اور dsDNA مالیکیولز جمع ہو جاتے ہیں۔
- آپ پرکھ کے اختتام پر یا تو جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے، یا مالیکیولر بیکن کا استعمال کرتے ہوئے اصل وقت میں ایمپلیفائیڈ پروڈکٹ کا پتہ لگا سکتے ہیں۔
- ٹرانسکرپشن پر مبنی ایمپلیفیکیشن کا ایک فائدہ یہ ہے کہ انہیں تھرمل سائیکلر کی ضرورت نہیں ہے۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ ترقی پذیر ممالک اور لیبارٹریز محدود بجٹ کے ساتھ اسسز انجام دے سکتی ہیں۔ ان کے پاس تیز رفتار حرکیات بھی ہیں (کم سائیکل کی ضرورت ہے) اور وہ واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے کی مصنوعات تیار کرتے ہیں جو مختلف تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے پتہ لگانے کے لیے موزوں ہیں۔
- RNA وائرس کی وجہ سے انسانی وائرل انفیکشن کی تشخیص کے لیے، ٹرانسکرپشن پر مبنی ایمپلیفیکیشن کے طریقے مناسب ہیں۔
- وہ وائرل میسنجر آر این اے، وائرل جینومک آر این اے اور رائبوسومل ڈی این اے کو بڑھا سکتے ہیں۔
درخواست
- آئیلے وغیرہ۔ آئیلے وغیرہ۔ یہ پرکھ اعلی حساسیت اور مخصوصیت کے ساتھ C اور C دونوں ذیلی قسموں کا پتہ لگانے کے قابل تھا (90.5٪ حساسیت، 100٪ مخصوصیت اور 95.2٪ خصوصیت بالترتیب C بیکنز کے لئے) اور ترتیب کو جین ٹائپنگ کے لئے سونے کا معیار سمجھا جاتا ہے۔
- مور وغیرہ۔ NSABA کا استعمال طبی نمونوں میں انفلوئنزا A H5N1 وائرس کے انفیکشن کا پتہ لگانے کے لیے بھی کیا گیا تھا۔ اس میں 10 RNA کاپیاں/ml پر ایک LoD ہے، RTPCR جیسی حساسیت اور ٹرناراؤنڈ ٹائم۔
- ڈینگی وائرل RNA کا پتہ لگانے کے لیے NASBA ٹیسٹ کا استعمال کیا گیا۔ اس میں 1 PFU/ml کا LoD تھا اور JEV کے ساتھ کوئی کراس ری ایکشن نہیں تھا۔ ٹرناراؤنڈ ٹائم 3 گھنٹے تھا۔
- اینڈر وغیرہ۔ TMA کا استعمال HIV-1 اور HCVRNA کے لیے خون کے عطیہ دہندگان کی اسکریننگ کے لیے کیا گیا تھا۔ TMA میں LoDs 16.2 IU/ml HIV-1 اور 3.5IU/ml HCV تھے۔
- ملٹی پلیکس NASBA کو پلازما کے نمونوں سے بیک وقت HIV-1 اور HCV کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ HIV-1 اور HCV LoD 1000 کاپیاں/ml تھا۔ کوئی کراس رد عمل نہیں تھا۔
- Swenson and his coworkers used real-time TMA to detect HSV-1 in lesion swab samples. They had overall sensitivities at 98.2%, 99.4%, and specificity at 97.8%, respectively, as compared with culture.
(ii) TMA پر مبنی اسیسز
- HIV-1 اور HCV کا پتہ لگانے کے لیے TMA پر مبنی ٹیسٹ تجارتی طور پر دستیاب ہیں۔ انہیں ہولوجک (سان ڈیاگو CA، USA) نے تیار کیا تھا۔
- Aptima HCVRNA کوالٹیٹیو پرکھ سیرم یا پلازما میں HCVRNA کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
- TMA کا استعمال 5′-UTR HCV جینوم کے اندر محفوظ علاقوں کو بڑھانے کے لیے کیا جاتا ہے۔
- پرکھ کا ایل او ڈی 7.5IU/ml اور ایک خاصیت 99.6% ہے۔
- BioMerieux Clinical Diagnostics HIV-1، CMV اور enterovirus کا پتہ لگانے کے لیے تجارتی طور پر دستیاب NASBA پر مبنی کٹس بھی پیش کرتا ہے۔
- BioMerieux، Marcy l'Etoile فرانس میں NucliSens Easy Q RSV B پرکھ تیار کیا۔ اس کا استعمال مختلف قسم کے سانس کے نمونوں میں RSV کا پتہ لگانے کے لیے کیا جاتا ہے۔
- یہ پرکھ ریئل ٹائم NASBA کا استعمال کرتی ہے اور RSV کے F جین کو نشانہ بناتی ہے۔
TMA اور NASBA کے فوائد
- حساس، مخصوص
- یہ آسان اور تیز ہے (کم سائیکل کی ضرورت ہے)۔
- ملٹی پلیکسنگ کے لیے ممکنہ
- مقدار کا تعین
- جینی ٹائپنگ
- اسے تھرمل سائیکلر کی ضرورت نہیں ہے، کیونکہ رد عمل 41 ڈگری سینٹی گریڈ پر دوسرے تھرمل طور پر ہوتا ہے
TMA اور NASBA کی حدود
- RNA کو سنبھالنا مشکل ثابت ہو سکتا ہے۔
- NASBA کے لیے تین خامروں کی ضرورت ہے۔
- انزائمز کا استعمال جو تھرموسٹیبل نہیں ہیں۔
- چونکہ درجہ حرارت جس پر پروردن ہوتا ہے کم ہے (41degC)، غیر مخصوص تعاملات بڑھ سکتے ہیں۔
5. لوپ میڈیٹڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن (LAMP)
- LAMP ایک متبادل isothermal nucleic acids amplification کا طریقہ ہے۔ یہ انسانی نمونوں کے اندر ڈی این اے اور آر این اے وائرس کی حساس، مخصوص اور تیز رفتار شناخت کے لیے بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے۔
- نوٹومی اور ان کے ساتھی اس طریقہ کار کو تیار کرنے والے پہلے تھے۔ اس نے تشخیصی وائرلولوجی میں تیزی سے مقبولیت حاصل کی۔
- ہدف کے ڈی این اے کو بڑھانے کے لیے، یہ طریقہ چار سے چھ مختلف پرائمر اور ڈی این اے پولیمریز کا استعمال کرتا ہے جس میں ڈی این اے اسٹرینڈ ڈسپلیسمنٹ سرگرمی ہے۔
- The LAMP assay can be used to quickly detect a variety of DNA viruses in human samples. This includes HSV-1 with LoD 10 copies of HSV-1DNA/ml with no cross-reactivity and no cross reactions with other select viruses. hAdV40/hAdV41 with LoD between 50 and 100 DNA/reaction with no cross-reactivity and turnaround time time of 60 mins. EBV with sensitivity and specificity of 86.4% and CMV with LoD 10 DNA copies/ml with no cross-reactivity and 1 hour after RNA extraction.
فوائد
- انتہائی حساس اور عین مطابق۔
- یہ کرنا آسان ہے۔
- اس کے لیے مہنگے تھرمل سائیکل کی ضرورت نہیں ہے۔
- تیز (1 گھنٹے کے اندر نتائج)۔
- مقداری
- جین ٹائپنگ۔
- سادہ پتہ لگانے کے نظام (ننگی آنکھ کا استعمال کرتے ہوئے)۔
- نمونہ کسی بھی روک تھام کے لیے نسبتاً مزاحم ہے۔
حدود
- چھ پرائمر کی ضرورت ہے۔
- کراس آلودگی کا زیادہ خطرہ ہے۔
- ملٹی پلیکسنگ حدود کے تابع ہے۔
- ننگی آنکھ سے بصری شناخت کی ساپیکش نوعیت رنگ کے ادراک پر منحصر ہے۔
6. ڈی این اے مائیکرو رے
- ڈی این اے مائیکرو رے ٹیکنالوجی طبی وائرس کا پتہ لگانے کی صلاحیت رکھتی ہے۔
- ڈی این اے مائیکرو رے تشخیص کے لیے، ٹیسٹ کے نمونے میں فلوروسینٹلی لیبل والے وائرل نیوکلک ایسڈ کا استعمال ٹھوس سطحوں (مثلاً شیشے کی سلائیڈ) پر متحرک اولیگونوکلیوٹائیڈ مسائل کو اسکرین کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔
- یہ oligonucleotide تحقیقات ہدف وائرس کے جینوم کے لیے مخصوص ہیں۔
- فلوروسینس پر مبنی پتہ لگانے سے غیر متحرک تحقیقات کے درمیان ہائبرڈائزیشن کے نتائج کی مقدار درست کرنے کی اجازت ملتی ہے، فلوروسینٹ رنگوں کے ساتھ ہدف کی ترتیب، اور ان کا پتہ لگانے اور ان کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
- چین میں 2002 میں سارس کی وباء کے دوران ایک ڈی این اے مائیکرو رے کا استعمال ایک نئے کورونا وائرس ممبر کو دریافت کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔
- ڈی این اے مائیکرو رے ٹیکنالوجی کلینیکل نمونوں میں ممکنہ وائرس کی ملٹی پلیکس کا پتہ لگانے کی اجازت دیتی ہے۔ یہ ایک انتہائی تھرو پٹ ٹول ہے۔
حدود
- معمول کی طبی تشخیص بہت مہنگی ہے۔
- یہ محنت کش ہے اور
- یہ وقت طلب ہے (ہائبرڈائزیشن کے عمل میں کئی دن لگ سکتے ہیں)۔
- پرکھ کے ذریعہ صرف وائرل پیتھوجینز کا پتہ لگایا جاتا ہے۔
7. اگلی نسل کی ترتیب (NGS)
- این جی ایس وائرولوجی کی تشخیص میں ایک بہت مفید ٹول ہے کیونکہ یہ طبی نمونوں سے نکالے گئے وائرل نیوکلک ایسڈ کے ٹکڑوں کا تجزیہ کر سکتا ہے۔
- NGS میں عام طور پر ٹیسٹ کے نمونے کی تیاری، ایک یا زیادہ NGS پلیٹ فارمز کا استعمال کرتے ہوئے ہدف نیوکلک ایسڈ کے ٹکڑوں کی ترتیب اور مناسب بایو انفارمیٹک ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب ڈیٹا کا تجزیہ شامل ہوتا ہے۔
فوائد
- NGS is not dependent on prior knowledge of the genomic sequences of viral pathogens, unlike پیسیآر and DNA microarray.
- You don’t need target-specific پیسیآر primers or oligonucleotide probes.
حدود
- آپ کا آرڈر واپس حاصل کرنے میں کافی وقت لگتا ہے۔
- فی رن نمونوں کی زیادہ مقدار
- Sequencers مہنگے ہیں.
- بائیو انفارمیٹکس میں مہارت کی ضرورت ہے۔
B. وائرس کی امیونولوجیکل تشخیصی تکنیک
وائرل انفیکشن کے جواب میں، اینٹی باڈیز humoral برانچ کی طرف سے بنائے جاتے ہیں. امیونولوجیکل تشخیصی تکنیکوں کی ترقی وائرل انفیکشن کے اس قدرتی مدافعتی ردعمل پر مبنی ہے۔ کئی امیونولوجیکل تشخیصی طریقے ہیں جو طبی نمونوں میں انسانی وائرل انفیکشن کا پتہ لگا سکتے ہیں۔ ان میں ویسٹرن بلوٹنگ اور امیونو فلوروسینس، انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ، ویسٹرن بلوٹنگ اور امیونو فلوروسینس شامل ہیں۔ یہ اسیسز ایک اینٹیجن اینٹی باڈی کمپلیکس کی تشکیل پر مبنی ہیں۔ انہیں طبی نمونوں، پورے وائرس یا وائرل اینٹیجنز اور ایک اشارے کی ضرورت ہوتی ہے۔
1. انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA)
- ELISA uses enzyme conjugated antibodies to detect specific antiviral antibodies or viral antigens in human specimens.
- ایک مثبت نمونہ وہ ہوتا ہے جس میں ایک انزائم ایک اینٹی باڈی سے جڑا ہوتا ہے اور ایک بے رنگ کروموجینک سبسٹریٹ ہوتا ہے۔ اس کے نتیجے میں رنگین مصنوعات کی تشکیل ہوتی ہے۔
- اگر طبی نمونے میں کوئی اینٹیجن/اینٹی باڈی موجود نہ ہو تو کوئی رنگ پیدا نہیں ہو سکتا۔
- اینٹیجن اینٹی باڈی مرکب کی مقدار براہ راست رنگ کی شدت کو متاثر کرتی ہے۔
- آپ اپنی ننگی آنکھوں سے رنگ کی تبدیلی کا مشاہدہ کر سکتے ہیں یا جذب کی پیمائش کے لیے سپیکٹرو فوٹومیٹر استعمال کر سکتے ہیں۔
- ELISA has been performed with several enzymes including horseradish peroxidase and alkaline phosphatase. There are many types of ELISA. The two most common are the antigen-capture ELISA also known as sandwich ELISA and the antibody-capture ELISA.
- سینڈوچ ELISA detects viral antibodies by immobilizing antigen specific to the viral protein of concern on a microtiter-well; indirect ELISA detects antiviral antibodies in a patient sample through coating whole virus or viral proteins on a microtiter-well.
فوائد
- ELISA is sensitive.
- انجام دینا آسان ہے۔
- نتائج حاصل کرنے میں بہت کم وقت لگتا ہے۔
2. مغربی بلوٹنگ تجزیہ
- ویسٹرن بلوٹنگ، جسے امیونو بلوٹنگ یا پرکھ بھی کہا جاتا ہے، اینٹی وائرل اینٹی باڈیز اور وائرل پروٹین کا پتہ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
- For detection of viral proteins, denatured whole viral proteins are first separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
- وائرل پروٹین کو پھر نائٹروسیلوز جھلی پر الیکٹرو ٹرانسفر کیا جاتا ہے۔
- اس کے بعد، جھلی وائرل پروٹین کے لیے مخصوص انزائم کنجوگیٹڈ اینٹی باڈیز کے ساتھ انکیوبیٹ ہوتی ہے۔
- وائرل اینٹیجنز میں کروموجینک مادے کا اضافہ رنگین بینڈز بننے کا سبب بنے گا اگر پروٹین انزائم کے لیبل والے اینٹی باڈی کے پابند ہوں۔
- SDS/PAGE کا نشانہ بننے کے بعد، وائرل مخصوص ڈینیچرڈ پروٹین کو اینٹی وائرل اینٹی باڈیز کا پتہ لگانے کے لیے الیکٹروفورٹیکلی طور پر نائٹروسیلوز جھلی پر روک دیا جاتا ہے۔
- جھلی مریض کے سیرم کے ساتھ سیراب ہوتی ہے۔
- مریض کے سیرم میں وائرل پروٹین کے خلاف اینٹی باڈیز مخصوص وائرل پروٹین سے منسلک ہوں گی۔
- ایک انزائم کنجوگیٹڈ سیکنڈری اینٹی باڈی اینٹی ہیومن اینٹی باڈی کو کروموجینک سبسٹریٹ میں شامل کرنے کے نتیجے میں وائرل پروٹین کی جگہوں پر رنگین بینڈ بنتے ہیں۔
- طبی تشخیص میں امیونوبلوٹنگ کا استعمال سیرو سرویلنس کے ساتھ ساتھ انسانی وائرل انفیکشن کی تصدیق کے لیے ممکن ہوا ہے۔
3. امیونو فلوروسینس پرکھ
- کلینیکل نمونوں میں اینٹی وائرل اینٹی باڈیز یا وائرل اینٹیجنز کا پتہ لگانے کے لیے، عام طور پر امیونو فلوروسینس اسیس استعمال کیے جاتے ہیں۔
- اسسیس کی دو قسمیں ہیں: ڈائریکٹ امیونو فلوروسینس (DFA)، جو مریض کے نمونوں میں وائرس کے اینٹیجنز کا پتہ لگاتا ہے، اور بالواسطہ امیونو فلوروسینس (IFA)، جو طبی نمونوں کے اندر اینٹی وائرل اینٹی باڈیز یا وائرل اینٹیجنز کا پتہ لگاتا ہے۔
- ڈی ایف اے ایک اینٹی باڈی کا استعمال کرتا ہے جو وائرس اینٹیجن کو براہ راست فلوروسینٹ ڈائی کے ساتھ جوڑنے کے لیے پہچانتا ہے۔ IFA دوسرے فلوروسینٹ لیبل والے اینٹی ہیومن اینٹی باڈی کے ساتھ وائرل اینٹیجن مخصوص اینٹی باڈیز کا پتہ لگاتا ہے۔
- IFA DFA سے زیادہ حساس ہے، کیونکہ متعدد فلوروسینٹلی لیبل لگا ہوا اینٹی-امیونوگلوبلین اینٹی باڈی ہر ایک اینٹی وائرل اینٹی باڈیز سے منسلک ہوتا ہے جس میں ہر سائٹ پر فلوروسینس کی شدت میں اضافہ ہوتا ہے۔
- فلوروسین آئسوتھیوسائنیٹ، جسے FITC بھی کہا جاتا ہے، تشخیصی وائرسولوجی میں سب سے زیادہ استعمال ہونے والا فلوروسینٹ ڈائی ہے۔ یہ ایک شدید پیلے رنگ سبز فلوروسینس کا اخراج کرتا ہے۔ تاہم، روڈامین ایک گہری، سرخ فلوروسینس کا اخراج کرتی ہے۔
- داغ لگنے کے بعد، واقعہ کی UV روشنی کا استعمال کرتے ہوئے نمونہ کو فلوروسینس مائکروسکوپ کے تحت جانچا جا سکتا ہے۔
- SARS کی تشخیص IFA کا استعمال کرتے ہوئے ہوئی۔
4. Hemagglutination inhibition (HI) Assay
- ڈینگی وائرس اور روبیلا وائرس، اڈینو وائرس اور روبیلا وائرس سمیت متعدد وائرسز کی سطحوں پر ہیماگلوٹینن اینٹی باڈیز ہوتی ہیں۔ یہ آر بی سی سے منسلک ہوتا ہے اور اسے ہیمگلوٹینیشن کے نام سے جانا جاتا ہے۔ HI assays کی نشوونما کے لیے، وائرس کی RBCs کو جمع کرنے کی صلاحیت کو روکا جا سکتا ہے۔
- سیریل ڈائیوشنز HI پرکھ میں سیرم کے نمونے سے مائکرو ٹائٹر پلیٹ کا استعمال کرتے ہوئے بنائے جاتے ہیں۔
- اگلا، وائرل ہیماگلوٹینن کی ایک مخصوص مقدار شامل کی جائے گی۔
- آخر میں، مناسب RBCs کو شامل کیا جا سکتا ہے۔
- HA کی عدم موجودگی سے ایک مثبت ردعمل ظاہر ہوتا ہے۔
- یہ مائکرو ٹائٹر پلیٹوں کو جھکا کر کیا جا سکتا ہے، جو RBCs کو آزادانہ طور پر بہنے دیتا ہے۔
- ریکارڈ شدہ گھٹاؤ کی شرح ہے جس پر آر بی سی جمع کی مکمل روک تھام واقع ہوئی ہے۔
- اس لیے HI ٹائٹر آخری سیرم کے اختلاط کا باہمی ہے جو HA کو مکمل طور پر روکتا ہے۔
- اس پرکھ کا استعمال انفلوئنزا A (H1N1) وائرس pdm09 اور خسرہ کے وائرس کو سیرو سرویلنس کرنے کے لیے کیا گیا تھا۔
- HI پرکھ کا استعمال کرتے ہوئے وبائی انفلوئنزا ویکسین کی تاثیر کا اندازہ لگایا جا سکتا ہے۔
امیونولوجیکل تشخیصی تکنیک کے فوائد
- حساسیت اور مخصوصیت کی اعلی سطح
- یہ کرنا نسبتاً آسان ہے۔
- تیز رفتاری اور بیک وقت متعدد نمونوں کی جانچ کرنے کا امکان۔
امیونولوجیکل تشخیصی تکنیکوں کی حدود
- مداخلتیں ہوسکتی ہیں۔ کراس ری ایکٹیو ایجنٹوں کی موجودگی جو وائرل اینٹیجن سے ملتے جلتے یا ایک جیسے ایپیٹوپس رکھتے ہیں مدافعتی نظام میں مداخلت کا سبب بن سکتے ہیں۔
- اگرچہ نمونے میں وائرل اینٹیجن کا کوئی ثبوت نہیں ہے، endogenous antigens پتہ لگانے والے اینٹی باڈیز یا اینٹی وائرل اینٹی باڈیز کے ساتھ تعامل کر سکتے ہیں اور غلط مثبت نتائج کا سبب بن سکتے ہیں۔
- جب ملیریا کی بیماری ان علاقوں میں کی جاتی ہے جہاں امیونوساز کی جاتی ہے تو ان کی مخصوصیت سے سمجھوتہ کیا جا سکتا ہے۔
- HI پرکھ وقت طلب اور محنت طلب ہو سکتی ہے۔
- چونکہ اسیس کے لیے کوئی معیاری ری ایجنٹس نہیں ہیں، اس لیے نتائج کی تشریح لیبارٹریوں کے درمیان مختلف ہو سکتی ہے۔
- اگر نمونہ IF کے لیے استعمال کیا جا رہا ہے، تو یہ طویل عرصے تک الٹرا وائلٹ روشنی کے سامنے آ سکتا ہے۔ یہ فلوروسینس کو ختم کرنے کا سبب بن سکتا ہے اور غلط-منفی نتائج کا باعث بن سکتا ہے۔
- کچھ امیونوساز کو مہنگے آلات اور ری ایجنٹس کی ضرورت ہوتی ہے۔
حوالہ جات
- ڈینیل حسین ریٹا، ٹیسفے سیسے تسیما، اڈیس سماچیو اشنیف، اڈی فیلیک دیسٹا، واجانا لاکو لیبیسو، سلیمان تبیجے گیزاو، سولومن میکانینٹے ابے، ڈینیئل سیفو میلکا، فصیحہ الیمو ریٹا، جووائیکلیولر اینڈ امیونولوجیکل ڈائیگنوسٹک بین الاقوامی میڈیکل ٹیکنولوجیکل ڈائیگنوسٹک۔ مائکرو بایولوجی، والیوم۔ 2020، آرٹیکل ID 8832728، 19 صفحات، 2020۔ https://doi.org/10.1155/2020/8832728
- https://agrilife.org/vetmed/files/2012/10/LS_5_4_sample_lesson.pdf
- https://virology-online.com/general/Tests.htm
